湿热灭菌柜使用灭菌的四个阶段如下： 先是升温准备阶段。灭菌箱的夹克先进导入蒸汽，使夹克升温到121的同时加热夹克内部的空气。作用于夹克升温的内室升温作用于蒸汽时，蒸汽接触的内壁和内部空气凝结而不成水。如果不升温，热蒸汽与冷内壁和空气接触会产生冷凝水，存在内腔温度不均匀、灭菌物干燥度不充分等问题。
之后是升温阶段。可以用真空泵利用水流排出灭菌箱内的冷空气，在达到负压状态的同时排出灭菌物内部的空气。然后投入饱和热蒸汽，迅速渗透到物体内部，即可获得饱和蒸汽置换空气的效果。重复这三次或四次，空气置换会比较*，温度会上升到121。
之后，是灭菌阶段。灭菌阶段，连续投入少量饱和蒸汽，排除部分蒸汽。内室温度保持在121，内室压力约为110KPa左右。在高温和高压的作用下，使微生物蛋白变性凝固失活达到灭菌要求。
最后是干燥阶段。抽真空释放内部蒸汽，然后补充过滤后的热压缩空气。(灭菌柜有换热器和除菌过滤器，压缩空气进入内腔先用除菌过滤器过滤，再用换热器加热进入设备内腔。如果不加热，冷压缩空气就会进入内腔使蒸汽凝结成水，如果不过滤就会导入细菌，灭菌失败。)在这里强调，干燥是与升温几乎相反的过程。
湿热灭菌柜常用的几种灭菌方法：
1、高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌在专业压力蒸汽灭菌器中进行，是一种普遍用于热灭菌、效果可靠的方法。其优点是贯通力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。
2、巴氏消毒法：利用热量杀灭液体中病原菌和常见杂菌，同时不明显损害其质量的消耗方法。巴斯德为消毒醇类而制作的故名。加热61.1~62.8分钟，或71.715~30秒钟。常用于牛奶、酒类等的消毒。
3、流通蒸汽灭菌法：用100左右水蒸气消毒。一般采用流通蒸汽灭菌器(其原理相当于我国蒸锅)，加热15至39分钟，即可杀灭细菌繁殖体。消毒物品的包装不要太大或太紧，以利于蒸汽的渗透。
4、煮沸法：100煮沸5分钟，可杀灭一般细菌繁殖体。很多芽孢经过煮潮5~6小时就会死亡。向水中加入2%碳酸钠，沸点达到105。既能促进芽孢的杀灭，又能防止金属器生锈。煮沸法可用于饮水和一般器具(刀具、注射器等)的消毒。5、间歇灭菌法：利用多次重复流通蒸汽达到灭菌目的。一般采用流通蒸汽灭菌器，100加热15~30分钟，即可杀死其中的繁殖体；芽孢还留着。取出后在37的培养箱过夜，使芽孢发育成繁殖体，第二天再蒸一次。把这个坚持三次以上。本法适用于耐高温营养素如血清培养基灭菌。
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